Comment détecter NADH

Nicotinamide adenine dinuceltoide (NADH) , en abrégé " NAD " , est un co-enzyme présente dans les cellules vivantes, qui produit des réactions chimiques dans les protéines. Les sociétés pharmaceutiques étudient NADH en raison de son processus de métabolisme , et synthétiquement créer pour un certain nombre d'objectifs . Depuis NADH est microscopique , à l'œil nu ne peut pas repérer. Vous devez tests scientifiques et d'un kit de test pour détecter sa présence . Choses que vous devez glace
sec
Micro - centrifugeuse Eppendorf
tubes
afficher Instructions
Reconstitution des réactifs
1

Définir le tampon de cyclisme sur un compteur et laissez le tampon pour atteindre la température ambiante . La température idéale pour la mémoire tampon est de 22 degrés Celsius .
2

Reconstituer le NAD vélo enzyme mélange avec exactement 220 microlitres de tampon de cyclisme . Congeler la solution à des températures en dessous de -70 degrés Celsius .
3

Reconstituer le développeur de NADH avec 1,2 ml de ddH2O . Mélanger doucement la solution jusqu'à ce qu'elle soit complètement dissoute. Ne pas vortex .
4

standard Reconstituer NADH avec 200 microlitres de diméthylsulfoxyde pur .
Préparation des échantillons
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Laver les cellules avec solution saline tamponnée au phosphate .
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Pellet 2x10 ( 5 ) cellules pour chaque test individuel dans un tube de micro- centrifugeuse et fonctionnent à 2000 RPM pendant 5 minutes .
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extraire les cellules avec 400 microlitres de tampon d'extraction NAD /NADH par congélation et décongélation des cellules dans deux cycles - 20 minutes sur de la glace sèche et 10 minutes à température ambiante . Agiter les cellules extraites pendant exactement 10 secondes.
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tourner les échantillons de cellules dans une micro- centrifugeuse à 14 000 RPM pendant exactement 5 minutes .
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Transférer le NAD /cellules de NADH dans un tube propre .
protocole de test 10

Diluer 10 les microlitres de
de la norme de NADH avec 990 microlitres de tampon d'extraction NAD /NADH . Ajouter 0, 2, 4, 6, 8 , 10 microlitres de la solution diluée dans une plaque de 96 puits en double exemplaire à créer 0 , 20, 40, 60 80 , 100 et norme . Remplissez le dernier bien avec 50 microlitres de tampon d'extraction NAD /NADH .
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transfert 50 microlitres d' échantillons de cellules extraites dans une plaque de 96 puits en double comme avant .
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Préparer les échantillons de cellules de détection de NADH . Décomposer le NAD à partir des échantillons de cellules en mettant 200 microlitres des échantillons de cellules extraites dans des tubes eppendorf . Chauffer les tubes à 60 ° C pendant exactement 30 minutes dans un bain d'eau à température contrôlée. Refroidir rapidement les échantillons en plaçant les tubes sur de la glace . Faites tourner les échantillons dans le micro- centrifugeuse pour éliminer les précipités . Transfert 50 microlitres des échantillons décomposés en une plaque de 96 puits en double comme avant .
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Mélanger le cyclisme mélange de tampon de NAD avec 100 microlitres de NAD vélo mélange de tampon et 2 microlitres de NAD vélo enzyme . Ajouter 100 microlitres de cette nouvelle solution dans chaque puits des normes et des échantillons NADH .
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Incuber la plaque à température ambiante pendant 5 minutes exactement . Ce processus permet de convertir le NAD en NADH .
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Ajouter 10 microlitres de NADH développeur dans chaque puits . Laisser la plaque à reposer à température ambiante pendant un minimum de 1 heure et un maximum de 4 heures.
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Lire la plaque et calculer le NADH .

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