Comment tester pour Nucleic Acids

Essais pour les acides nucléiques est réalisée dans le diagnostic médical afin de détecter des agents pathogènes , comme les virus ou les bactéries . Ces tests sont beaucoup plus rapides et, par conséquent , permettent un médecin pour commencer un traitement pour un patient qui normalement aurait dû attendre la confirmation de l'infection en utilisant des essais à base d'anticorps plus longues et fastidieuses . Le procédé est également connu comme un test d'amplification d'acide nucléique , et comprend un procédé connu sous le nom " amplification de la transcriptase inverse " par réaction en chaîne de la polymérase . Comme il s'agit d' une procédure scientifique hautement spécialisée , des connaissances avancées et de l'expertise dans les techniques de la biologie moléculaire et la théorie est nécessaire . Choses que vous devez
tubes PCR
cycleur PCR
Pipettes et pointes à filtre
Gants
cellules
Trizol ou autre réactif d'extraction d'ARN tampon PCR
Taq polymérase
amorces de RT-PCR à une concentration mg /ml
eau RNase
dNTP
MgCl2
amorces aléatoires à 1,8 mg /ml de concentration
SuperScript II transcriptase inverse

Afficher Instructions Photos de traitement et de préparation de l'ARN
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cellules de récolte avec un réactif d'extraction d'ARN , comme Trizol . 1 ml , est suffisante pour collecter des cellules d'un puits d'une plaque de culture tissulaire à six puits . Les cellules sont soigneusement la pipette de haut en bas pour les homogénéiser et ensuite effectuer la procédure d'extraction comme décrit dans la fiche Trizol . En bref, on extrait avec du chloroforme , puis centrifugation pour séparer les phases de l'ADN , des protéines et de l'ARN . Récupérer que la phase d'ARN incolore et précipiter que l'isopropanol. Après incubation , centrifugeuses et nettoyer le culot résultant de plusieurs lavages à l'éthanol . Puis remettre le culot dans l'eau sans RNase .
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Pour la transcription inverse , dénaturer exactement 5 microgrammes d'ARN à 65 degrés Celsius en 10 microlitre ( ul ) volume d'eau sans RNase , puis rapidement placer sur la glace . Pour chaque réaction , mélanger 10 ul d'ARN , 3 ul de tampon de réaction 10X PCR , 2,5 ul de 10 dNTP millimolaire , 6 litres de 25 mM de chlorure de magnésium, 1 ul d'amorces aléatoires de 1,8 milligramme par la concentration en millilitre , et 0,5 ul de SuperScript II enzyme transcriptase inverse . Compléter chaque réaction avec 17 ul d'eau sans RNase . Incuber les tubes à la température ambiante pendant dix minutes, puis à 42 degrés Celsius pendant une heure pour produire l'ADNc , puis dénaturer à 95 degrés Celsius et rapidement la glace pour arrêter la réaction .
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pour une réaction en chaîne par polymérase , à nouveau mise en place d'un mélange réactionnel dans 0,5 ml tubes en combinant 6 ul d' ADNc faite à la réaction inverse de la transcription, 1,5 ul de tampon de réaction 10X PCR , 0,2 microlitre de polymerase Taq , 0,5 microlitre d' amorce inverse et également de l'amorce avant, puis recharger chaque tube avec 10,3 ul d'eau sans RNase . Pour exécuter les réactions , mis en place un cycleur thermique (c'est à dire une machine qui effectue les réactions en chaîne de la polymérase ) pendant 30 cycles comme suit: 95 ° C pendant 0,5 minute pour dénaturer , suivi par 60 degrés Celsius pendant 45 secondes à recuit , et enfin 72 degrés Celsius pendant 1 minute à étendre la transcription synthétisés .