Électrophorèse sur gel pour le dépannage

électrophorèse sur gel de polyacrylamide ou PAGE , est une technique couramment utilisée pour la séparation de molécules organiques dans un échantillon biologique . Les molécules de taille plus faible et de poids plus rapide migrer sur un gel de polyacrylamide , lorsqu'un courant électrique est appliqué . Bandes claires et distinctes sont généralement observés après le gel complet est incubé dans une tache particulière. Il s'agit d'une méthode relativement simple . Cependant, l'absence de bandes ou de bandes susceptible de salir ou impure peut indiquer un problème dans une ou plusieurs étapes du procédé . Vous devez suivre les directives de base pour résoudre une méthode d'électrophorèse sur gel quand les résultats ne sont pas comme prévu . Choses que vous devez
qualité bis de qualité : l'acrylamide ou de l'acrylamide de deux plaques de verre de préfabriqués plaques : Bis
TBE tampon ( Tris , d'acide borique , de l'EDTA )
Alimentation Photos Haute- chambre tampon chambre
tampon Basse
protéines de l'échantillon d'ADN
TEMED
ammonium persulfate Photos Gel tache
Voir Instructions
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Commencez avec l'étape finale de l'électrophorèse sur gel et la première marche arrière. Par électrophorèse sur gel, l' étape finale est le protocole de coloration utilisé pour observer les bandes d'échantillons. Peu de problèmes doivent effectivement se produire pendant la procédure de coloration . Toutefois, les taches en poudre doivent être bien dissous dans le tampon approprié avant d'être utilisés pour colorer un gel. Déterminer la concentration correcte de la tache a été utilisé .
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Vérifier l'alimentation . L' absence de bandes pourrait indiquer le réglage actuel ou de la tension est trop élevée et les échantillons d'essai ont migré hors du gel . Les réglages élevés peuvent également causer composants de l'échantillon de migrer à travers le gel trop vite , provoquant une faible résolution et des bandes qui apparaissent impur . Les échantillons peuvent pas migrer à travers le gel si le réglage de l'alimentation est faible . Les échantillons peuvent également dériver du puits où ils ont été chargés et ne pas migrer à travers le gel .
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Vérifier l' acrylamide liquide utilisé pour couler le gel de polyacrylamide . En règle générale, le pourcentage d'acrylamide utilisé pour couler une gammes de gel de polyacrylamide de 5 à 15 pour cent . Les échantillons constitués de molécules plus grosses sont chargés sur un gel de 5 pour cent en raison de grands fragments se déplacent plus lentement sur ​​des gels avec un pourcentage d'acrylamide plus élevé. Les petites molécules sont chargés sur un gel de pour cent plus élevé en raison d'une concentration de gel bas ne serait pas capable de résoudre des échantillons plus petits .
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Vérifiez les réactifs utilisés pour polymériser l' acrylamide . Un gel de polyacrylamide est formé par polymérisation d'un mélange liquide constitué d' acrylamide et de bisacrylamide . Le persulfate d'ammonium et le TEMED sont ajoutés à l' acrylamide pour catalyser la formation de gel . Typiquement, l' acrylamide devrait montrer des signes de polymérisation ( formation de gel ) 15 minutes après le persulfate d'ammonium et le TEMED ont été ajoutés. Polymérisation qui se produit trop rapidement est le résultat de grandes quantités de persulfate d'ammonium. Trop peu de persulfate d'ammonium peut provoquer une polymérisation incomplète ou irrégulière .
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Confirmez la quantité des échantillons chargés . Des concentrations élevées d'échantillons peuvent se déplacer lentement à travers le gel et réduire la résolution de la bande. Une concentration de l'échantillon qui est faible ne peut pas être observée après le gel a été souillé . Ces taches ont des limites quant au montant minimum de l'échantillon qui peut être représenté comme un résultat de la sensibilité aux taches .
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qualité des échantillons chargés de confirmation. Des sels et d'autres contaminants présents dans un échantillon peuvent influer sur le mouvement de l'échantillon le long du gel . L'électrophorèse est le résultat d' un courant électrique qui traverse un gel qui contient un tampon conducteur de courant; des concentrations de sel élevées dans l'échantillon peuvent affecter la circulation de ce courant à travers le gel . Votre isolement d'un échantillon devrait intégrer un kit de purification qui va produire un échantillon relativement pur .
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littérature de l'avis ou le protocole écrit pour déterminer si la bonne page a été utilisé pour réaliser l'expérience . Le pourcentage d' acrylamide dans PAGE est spécifique à la taille de l' échantillon à tester . La littérature pourrait également fournir des informations spécifiques à l'égard de mettre en place de l'alimentation et le taux de migration de l'échantillon .