Comment mesurer la viabilité cellulaire

Dans la plupart des expériences biologiques impliquant la culture cellulaire , une étape cruciale de savoir quels comprend des cellules sont vivantes et qui sont morts dans l'échantillon . Exclusion colorant est la méthode la plus populaire de mesure de la viabilité cellulaire . Exclusion de colorant est basée sur la théorie selon laquelle les cellules vivantes comprennent des membranes intactes et les cellules mortes n'ont pas , par conséquent les cellules mortes absorbent le colorant dans le cytoplasme. Il existe différents colorants et les protocoles et les méthodes que vous choisissez doivent être basées sur le coût , la sensibilité , la facilité et la longueur de la procédure . Le bleu trypan est un colorant couramment utilisée pour mesurer la viabilité des cellules , car la procédure peut être effectuée en cinq à 10 minutes et ne coûte que la quantité du réactif de colorant. Choses que vous devez
0,4 % trypan réactif bleu et lamelle
Hémacytomètre
les Pointes de pipettes de micropipettes
tampon phosphate salin ( PBS ) Photos microscope optique

Afficher Instructions
1

obtenir un culot de cellules que vous mesurez .
2

Remettre en suspension le culot cellulaire dans du PBS pour obtenir environ 5 x 105 cellules /ml . PBS est utilisé parce que des mesures de viabilité sont plus précis quand les cellules sont dans un environnement exempt de sérum; protéines sériques peuvent également colorer et vous donner des résultats trompeurs .
3

Ajouter à parts égales de suspension de cellules dans du PBS à parts égales de 0,4 % trypan colorant bleu pour obtenir une dilution de 1 à 2 ( exemple : . 100 ul de cellules à 100 ul de bleu trypan ) et mélanger par pipetage de haut en bas
4

Incuber mélange pour moins de trois minutes à la température ambiante . Si les cellules sont comptées après environ cinq minutes , la viabilité sera inexacte en raison de la mort cellulaire .
5

Avec la lamelle déjà en place , remplir chaque côté d'un compteur de hémacytomètre avec la suspension cellulaire . Typiquement , chaque côté aura 10 à 20 ul .
6

Placez le hémacytomètre sur la scène d'un microscope optique et de se concentrer sur les cellules.
7

Chaque côté de l' hématimètre contient plusieurs places . Compter le nombre total de cellules dans un carré de la hématimètre . Puis de compter le nombre de non - viable ( bleu) et les cellules viables (effacer) séparément , sur la même place .
8

Calculer le pourcentage de cellules viables dans le carré en divisant le nombre de cellules viables par le nombre de cellules totales et en multipliant par 100 . Faites cela pour plusieurs places sur la hémacytomètre pour obtenir une mesure de la viabilité moyenne .