Comment mener une FRET Composition

transfert d'énergie par résonance de fluorescence ( FRET) est une technique d' analyse utilisée pour mesurer la présence et la quantité de liaison entre deux protéines rapporteurs liés . Ce dosage est couramment utilisé pour analyser les protéines de liaison potentiellement dans divers types de cellules , et pour mesurer l'efficacité des enzymes de type conjugaison . Le matériel de détection nécessaire dépend en grande partie des types de molécules rapporteurs utilisés , bien que de nombreuses fois un lecteur de plaques à 96 puits simples peuvent être utilisés . Choses que vous devez
Protein-of-interest/Reporter molécule constructions pour chaque protéine testée
96 puits bloc de plaque
le tampon de réaction de lecteur de plaques à 96 puits (en général Tris ou phosphate à base de solution saline tamponnée ) Photos Conjugaison enzyme (si nécessaire)
Afficher Instructions
configuration et de lecture
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Générer ou préparer constructions de fusion de chaque protéine d'intérêt , chacun étant lié à une molécule de transmission de fluorescence telles que la protéine fluorescente verte (GFP) , la rhodamine ou du bore dipyrrométhène ( BODIPY ) .
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Déterminer absorption et d'émission des longueurs d'onde de chaque composant fluorescent et d' le dosage d'ensemble . ( Par exemple, si le dosage mesure la GFP -> transfert Rhodamine d'énergie de fluorescence , la longueur d'onde d'entrée d'absorbance est celui de l' absorbance de la GFP ( 488 nm) , et la longueur d'onde de détection d'émission est celle pour la rhodamine ( 595 nm ) ) Photos .
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Créer tampon de réaction appropriée de l'expérience , en fonction des protéines de propriétés biochimiques de intérêt . Un tampon à base de TRIS - est souvent utilisé , y compris le chlorure de calcium et 0,05 pour cent de Tween-20 . Concentrations et des composants spécifiques peuvent être déterminées par la recherche d'entrées de journal détaillant réactions et des conditions similaires .
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Mélanger les deux protéines rapporteurs conjugué d'intérêt à différentes concentrations dans le tampon de réaction , et aliquote 50-200 ul par puits . Ajouter une enzyme de conjugaison ( par exemple , sortase ) à chaque puits d'échantillon , le cas échéant . Si vous effectuez un test de point final , permettra d'incubation à température ambiante ( ou température optimale de l'enzyme ) pour une période de temps déterminée , puis lire sur le lecteur de plaque de 96 puits . Si vous effectuez un essai cinétique , passez directement à la lecture ( voir ci-dessous ) . Plaque
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Insérer l'échantillon dans le lecteur de plaque de 96 puits . Créez une nouvelle page de l'expérience et accéder au menu des paramètres . Entrée de l'absorbance correcte ( d'excitation ) et des longueurs d'onde d'émission , puis sélectionnez les puits appropriés à lire .

Si l'exécution d'une étude sur la cinétique , fixer le temps long de l'expérience et de la durée de l'intervalle lectures ( par exemple une fois tous les 10 minutes) .

commencer à lire échantillon .

Analyser les données en utilisant la fonction graphique de Microsoft Excel ( ou un autre programme graphique tel que GraphPad ) .