Comment puis-je Line Up ADN pour l'analyse

? Électrophorèse sur gel d'agarose est la méthode la plus commune de l'analyse visuelle de fragment d'ADN , qui permet aux techniciens de fragments d'ADN visuellement discerner fonction de la taille . Le gel d'agarose subit un champ magnétique et , étant donné que l'ADN a une charge négative , il se déplace vers l'extrémité positive du champ magnétique . Des fragments d'ADN plus petits se déplacent plus rapidement à travers le gel et des fragments plus grands se déplacent plus lentement . Les fragments d'ADN sont colorées de manière fluorescente avec un agent d'intercalation connu comme le bromure d'éthidium. Ceci permet de comparer plusieurs échantillons d'ADN à une électrophorèse sur un gel. Choses que vous devez gel d'agarose Photos , 0,7 pour cent à 2 pour cent
Tris-borate -EDTA (TBA ) , tris - acétate -EDTA ( TAE ) , l'acétate de sodium de lithium (LA ) , de l'acide borique ( SB ) tampon Gel de plateau de chargement colorant
bromure d'éthidium Photos Gel
Gants électrophorèse chambre
lunettes de protection
pipette de électrophorèse peigne
Voir Instructions
Préparer un gel d'agarose 0,7 pour cent
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Peser 0,7 g de poudre d'agarose, puis le placer dans un grand ( 250 ml ) Fiole conique .
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Ajouter 100ml d'un tampon 1X ( de force régulière ) ( TAE , TBE , SB ou tampon LB ) à la fiole contenant la poudre d'agarose.
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à micro-ondes ou à la chaleur à l'aide d'un brûleur Bunsen pendant environ une minute jusqu'à ce que la solution devienne claire et la gélose a dissous .
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Retirer le ballon de la source de chaleur et laisser refroidir à 55 à 60 degrés Celsius .
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Ajouter 1 pi ( microlitre ) de bromure d'éthidium à la solution refroidie d'agarose en utilisant une pipette de taille appropriée , généralement de 1 ml . Agiter la solution pour mélanger .
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Verser le gel lentement dans le plateau de gel , s'assurer qu'il n'ya pas de formation de bulles lors de ce processus . S'il n'y a pas de barrages bien fournis avec le plateau de gel , utilisez du ruban adhésif pour les former .
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Placez un peigne d'électrophorèse avec précaution dans le gel , assurant une position ferme et dans le bon sens . Peignes d'électrophorèse peuvent varier considérablement sur ​​le nombre de dents qu'ils ont. Laisser prendre le gel pendant environ 25 minutes
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Recouvrir le gel dans le même tampon utilisé pour préparer la solution agaorse - . Dans ce cas , un tampon 1X . Recouvrir le gel jusqu'à 5 ml de tampon de migration .
Préparation et chargement de l'ADN dans le gel d'agarose pour l'analyse
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transfert de 5 à 10 pi de votre échantillon (s ) de leurs tubes de réaction à de nouveaux tubes . Dans le cas où vous souhaitez utiliser la totalité du mélange réactionnel , un nouveau tube n'est pas nécessaire .
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Ajouter tampon de chargement de 0,2 X à chacun de vos tubes d'échantillon frais contenant votre échantillon d'ADN pour le chargement .
Photos 11

Retirer le peigne d'électrophorèse lentement, en vous assurant de ne pas casser le gel ou de créer un espace entre le bas du gel et le plateau de gel .
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Ajouter cinq 12 uL d' un marqueur d' ADN approprié dans le premier puits créé par le peigne d'électrophorèse. Que ce soit ou non un marqueur d'ADN est appropriée dépend de la taille des fragments que vous attendez de votre échantillon .
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charge de cinq à 10 pi de vos échantillons dans les puits restants et ajouter une égale montant de la même marqueur d'ADN dans le bien final.
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Placer les électrodes dans la chambre d'électrophorèse en branchant les fils dans les prises correspondantes dans la chambre et mettre l'électrode de 50 à 150 V.
Photos 15

Laisser le gel de fonctionner pendant une à quatre heures .
analyse des résultats
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Retirer le gel de la chambre de gel et placer soit dans une chambre d' UV pour une identification visuelle , ou du lieu dans une machine qui est capable de prendre une photographie du gel .
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Mesurer la distance des marqueurs de la migration dans leurs puits .
Photos 18

tracer les distances contre la taille des bandes sur du papier millimétré semi-logarithmique et d'en tirer un meilleur ajustement .
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Calculer les distances de vos groupes inconnus .

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Estimer la taille de vos groupes inconnus en traçant une ligne à partir de la distance parcourue par vos groupes inconnus qui répond à la droite de meilleur ajustement .
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Tracez une autre ligne à partir de ce point de rencontre sur l' axe de la taille .