Instructions Western Blot

Western blot est une technique bien connue pour identifier des protéines spécifiques isolées à partir de tissu . Les différentes protéines sont d'abord séparés par la charge et le poids sur gel de SDS- polyacrylamide et transférés sur une membrane de nitrocellulose . Après le transfert, les anticorps marqués se lient spécifiquement avec la protéine désirée et sont photographiés en utilisant un film à rayons X ou visualisés par coloration spécifique à la protéine . Le résultat final montre des bandes sombres indiquant la présence de la protéine identifiée . Cet article se concentre sur la méthodologie de base pour effectuer une analyse Western blot dans un laboratoire qualifié pour la recherche de la protéine complexe . Choses que vous devez
gel de polyacrylamide-SDS ( SDS- PAGE ) avec distillée l'eau de protéines séparées de la membrane de nitrocellulose
transfert tampon ( 30 g de Tris , 144 g de glycine et 200 ml de méthanol dans 1 l eau )
papier filtre Whatman 3 mm
éponge de laboratoire
l'alimentation de laboratoire de chambre de transfert Western blot
réfrigérateur de laboratoire Laboratoire de l'agitateur
Tris solution saline tamponnée ( TBS ) ( 24,2 g de Tris base , 80 g de NaCl dans 1 litre d'eau )
solution de blocage ( 5 pour cent de lait écrémé en poudre dans du TBS )
solution d'anticorps primaire
étiqueté solution anticorps conjugué
solution de substrat de la phosphatase alcaline avec le bleu nitro tétrazolium tache
tampon phosphate salin ( PBS )
boîte Gel - imageur
Voir Instructions
Transfert protéines de membrane de nitrocellulose
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Préparer la membrane de nitrocellulose . La membrane doit être trempé dans de l'eau distillée pendant deux minutes , puis placées dans la mémoire tampon de transfert et autorisés à tremper pendant cinq minutes.
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Monter un sandwich de transfert constitué de papier éponge /filtre /SDS-PAGE /papier membrane de nitrocellulose /filtre /éponge . Le sandwich est aligné de sorte que la membrane est plus proche de l'anode et le gel plus proche de la cathode à l'intérieur de la chambre de transfert .
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au tampon de transfert dans la chambre de sorte que le sandwich est immergé. Mettre la chambre à l'intérieur du réfrigérateur de laboratoire. Transfert des protéines du gel sur la membrane doit être effectué à 4 degrés Celsius .
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Mettre en place l'alimentation de transférer les protéines du gel sur la membrane . Le sens de transfert vers l'anode est indiqué par le rouge de plomb . Grandes protéines se déplacent plus rapidement en réponse à un courant électrique et se déplace en premier. Le bloc d'alimentation contrôle la vitesse de transfert . Régler la puissance à 30 V et 40 mA pour un transfert pendant la nuit.
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Démonter l'alimentation après le transfert est terminé . Ne pas entrer en contact avec le tampon de transfert ou de supprimer le sandwich tandis que l'alimentation est attaché .
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Retirer la membrane du sandwich et incuber pendant deux heures dans une solution de blocage . Les protéines présentes dans la solution de blocage absorbent dans la membrane en l'absence de protéines sont présentes . Elle permettra d'éviter tout anticorps de se lier à la membrane où la protéine souhaitée n'est pas présente .
Liaison de l'anticorps
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Incuber la membrane de nitrocellulose avec une solution d'anticorps primaire à l'aide d'un agitateur . La membrane doit être complètement immergé dans la solution pendant au moins une heure . Il est acceptable de laisser incuber pendant la nuit.
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Laver la membrane à fond pour éliminer les anticorps non liés . Quatre lavages de 10 minutes séparées avec le SCT sont généralement suffisant pour éliminer l'excès d'anticorps .
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Incuber la membrane étiqueté solution anticorps conjugué à l'aide de l'agitateur. La membrane doit être incubé pendant un minimum d'une heure. Le conjugué d' anticorps marqué est lié à la phosphatase alcaline. C'est le mélange enzyme-anticorps qui reconnaissent et se lient à la première anticorps .
Détection de la protéine
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Rincer la membrane pendant 10 minutes dans du PBS quatre fois . Cela permettra d'éliminer le reste du conjugué anticorps marqué .
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Incuber la membrane dans une solution alcaline de substrat de la phosphatase jusqu'à des modèles de bande apparaissent . Le colorant dans la solution de substrat se lie à la protéine -antigène- anticorps dans la membrane et former une bande de couleur sombre . Le processus peut être immédiat ou nécessiter jusqu'à 30 minutes avant les bandes sont observées .
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Envelopper complètement la membrane dans du cellophane et le placer directement sur ​​le gel - imageur pour visualiser les résultats . Le gel - imageur est capable de photographier les résultats affichés sur la membrane de Western blot .