Biotinylation Protocoles
biotinylation est le processus de liaison de la biotine, ou vitamine H, à une protéine ou d'autres molécules. Cette procédure scientifique est principalement utilisé dans la biotechnologie et la recherche en biologie moléculaire impliquant l'ADN , les protéines et les antigènes , qui sont des molécules du système immunitaire du corps à reconnaître comme des envahisseurs . Les protocoles de biotinylation comprennent la biotinylation des anticorps et des peptides , ainsi que la biotinylation de la surface cellulaire . Biotinylation d'anticorps
Pour lier la biotine aux protéines d'anticorps produire quand un antigène pénètre dans le corps , les techniciens utilisent le bicarbonate de sodium ( NaHC03 ) à pH 9; diméthylsulfoxyde (DMSO );
NHS - biotine et une substance saline appelé PBS . Les échantillons sont mélangés avec du bicarbonate de sodium , qui est ensuite ajouté à la NHS- biotine dans du DMSO . La solution est ensuite ajoutée à l' anticorps analysés et mis en incubation sur un appareil appelé un rotateur pendant quatre heures à la température ambiante ou pendant une nuit à 39,2 degrés Fahrenheit. Enfin , la solution est diluée avec du PBS .
Surface cellulaire Biotinylation
Dans le protocole de biotinylation de surface cellulaire , les techniciens utilisent culture de tissu , tampon phosphate salin ( PBS) à pH 7,4 et sulfosuccinimidyl -2 - ( biotinamido ) éthyl-1 ,3 solution tampon - dithiopropionate de l'équilibre acidité contenant des groupes amino et TrisCl , selon Current Protocols in Protein Science.The cellules sont mélangées avec de la biotine et la solution tampon , décantés et centrifugés . Teneur en matières solides et des protéines spécifiques sont ensuite analysés sur une plaque d'électrophorèse sur gel .
Biotinylation de peptides
Pour effectuer la biotinylation de peptides , le réactif utilisé est NHS SS - biotine , selon Philip berger dans " anticorps monoclonaux : A Practical Approach ». Les peptides sont des fragments courts d'acides aminés, les molécules qui forment les protéines et l'ADN. Dans ce protocole , la solution commerciale NHS -SS biotine est dissous dans l'eau . Ensuite, l'échantillon de peptide est ajouté, en même temps que du bicarbonate de sodium pour équilibrer l'acidité ou pH . La solution est ensuite incubée sur de la glace pendant deux heures. Les techniciens peuvent observer l'échantillon avec ou sans les molécules de biotine .