Procédures de cryoconservation

procédures de cryoconservation sont ceux qui permettent aux cellules de stocker indéfiniment en utilisant des températures extrêmement froides de suspendre les activités métaboliques . Il existe deux principaux types de procédures de cryoconservation : équilibre ( congélation lente classique ) et de non-équilibre ou congélation ultra - rapide ( vitrification ) . Le terme vitrification vient du latin " vitreux " ou vitreux . Les deux procédés utilisent des cryoprotecteurs ayant des propriétés de type anti-gel pour prévenir les dommages cellulaires au cours du processus de congélation. Une fois que les cellules sont congelées ou vitrifiés , ils peuvent être stockés indéfiniment en les immergeant dans de l'azote liquide , un fluide extrêmement froid avec une température de -196 C ( -321 F). Pour rétablir l'activité métabolique de la cellule lors de la décongélation , des cryoprotecteurs toxiques doivent être enlevés de la cellule et l' équilibre de l'eau normale graduellement restaurées en tant que la cellule est renvoyée à une température de fonctionnement normale. Aperçu

Aperçu

procédures de cryoconservation sont ceux qui permettent aux cellules de stocker indéfiniment en utilisant des températures extrêmement froides de suspendre les activités métaboliques . Il existe deux principaux types de procédures de cryoconservation : équilibre ( congélation lente classique ) et de non-équilibre ou congélation ultra - rapide ( vitrification ) . Le terme vitrification vient du latin « vitreux » ou vitreux . Les deux procédés utilisent des cryoprotecteurs ayant des propriétés de type anti-gel pour prévenir les dommages cellulaires au cours du processus de congélation. Une fois que les cellules sont congelées ou vitrifiés , ils peuvent être stockés indéfiniment en les immergeant dans de l'azote liquide , un fluide extrêmement froid avec une température de -196 C ( -321 F). Pour restaurer l'activité métabolique dans la cellule lors de la décongélation , cryoprotecteurs toxiques doivent être retirés de la cellule et l'équilibre normal de l'eau progressivement restauré la cellule est renvoyé à une température de fonctionnement normale .

Cell- facteurs spécifiques

la procédure utilisée pour la cryoconservation des cellules ou des tissus dépend de plusieurs facteurs, notamment la taille de la cellule , la quantité de fluide cellulaire ( cytoplasme ) et la complexité de la cellule ( cellule unique ou tissu ) . Les cellules avec une grande quantité de cytoplasme comme les œufs sont plus difficiles à la cryoconservation de cellules avec seulement cytoplasme résiduel , comme les spermatozoïdes . La cryoconservation de tissu ovarien est plus difficile en raison d'au moins trois types de différentes tailles de cellules différentes sont présentes dans les tissus de l'ovaire , chacun avec des besoins différents de congélation optimales . Les protocoles de congélation lente ont été utilisés avec succès avec divers types de cellules . La vitrification est actuellement le plus efficace avec une seule cellule de congélation et moins efficace avec les tissus , mais les recherches se poursuivent pour optimiser la vitrification des tissus .
Rôle de cryoprotecteurs

Le cytoplasme des une cellule contient de l'eau , qui se transforme en cristaux de glace à la température de congélation. Quand la glace se forme à l'intérieur d'une cellule , la cellule est déchiqueté et meurt. Par conséquent, le fluide dans la cellule doit être retirée avant d'atteindre des températures de congélation afin d'éviter des dommages aux cellules . Différents types de fluides antigel ( cryoprotecteurs ) peuvent être utilisés pour déshydrater la cellule avant la congélation, comprenant le glycérol, le propanediol , le diméthyl sulfoxde (DMSO) , de l'éthanol et de sucres tels que le saccharose et le tréhalose. Le taux optimal de refroidissement ( et de la décongélation ) dépend du type de cryoprotecteur utilisé et de la caractéristique de la cellule ou de tissu d'être ( ou c'était ) congelé. Cryoprotecteurs sont toxiques pour le métabolisme des cellules de manière exposition de cellules à cryoprotecteurs à des températures plus chaudes métaboliques doivent être minimisés ou évités. Lors de la décongélation ou le réchauffement des cellules , cryoprotecteurs doivent être complètement retirés de la cellule avant l'activité métabolique est rétablie.
Équilibre par rapport aux non - équilibre procédure Cryoconservation

Le taux de gel dépend si le protocole de congélation est non fondée EQuilbrium équilibre ou . Pour des procédures de type à l'équilibre, la vitesse de congélation optimale est obtenue quand il existe un équilibre entre la vitesse à laquelle la cellule est déshydraté de l'eau et de la vitesse à laquelle l'eau à l'extérieur de la cellule est transformée à l'étape de la glace. Ces protocoles d'équilibre ou lente gel prennent habituellement des heures à remplir et un ordinateur est utilisé pour exécuter un congélateur à vitesse programmable pour s'assurer que les taux de gel sont exactement comme nécessaire . Il s'agit généralement d'un «hold» étape dans le protocole à proximité du départ pour permettre la création manuelle des cristaux de glace ou de démarrage " semis " dans le fluide à l'extérieur des cellules .

vitrification , une approche totalement différente de congélation qui ne repose pas sur des rampes et atteindre un équilibre entre la déshydratation et la formation de cristaux de glace est utilisée . La vitrification est donc ultra - rapide qu'il n'y a pas suffisamment de temps pour la formation de glace et le liquide cellulaire est directement convertie en une phase vitreuse ou verre , sans dommage pour la cellule . Congélateurs taux programmables ne sont pas nécessaires parce que la cellule est directement plongé dans l'azote liquide extrêmement froid , la réalisation d'un état ​​vitreux instantanée .
Lente -Freeze procédure

La première étape de la procédure de congélation lente consiste à exposer la cellule à l' agent cryoprotecteur dans un mode pas à pas progressif lentement pour permettre l'équilibrage de la cellule avec l'agent cryoprotecteur tout en libérant de l'eau . Une fois que les cellules ont été effacées de la majorité de l'eau cellulaire , les cellules dans le liquide cryoprotecteur sont placées dans un récipient quelconque, tel qu'une paille en plastique , d'une ampoule de verre ou un volume de vial.The plastique du liquide entourant les cellules pour congélation lente est généralement moins d'une cuillère à café et ne peut être quelques gouttes . Le conteneur pré- marqué est rempli , scellé et placé dans un congélateur programmable , ce qui diminue lentement la température du récipient sur ​​une période de quelques minutes ou heures à des températures très basses . Après quelques minutes de refroidissement , les cristaux de glace starter doivent être formées à l'intérieur du récipient par " ensemencement " le conteneur. L'ensemencement est effectué en utilisant un outil (par exemple, une pince ) qui ont été pré - refroidi dans de l'azote liquide à toucher le récipient et provoquer la formation de cristaux de glace . Ce cristal de démarreur initier la formation de cristaux de glace contrôlé en un seul endroit , en toute sécurité loin des cellules . Une fois le semis est terminée , le reste des rampes de refroidissement peut continuer. Lorsque le conteneur atteint des températures comprises entre -30 et -85 C , le récipient contenant les cellules peut être plongé directement dans l'azote liquide pour compléter le refroidissement à -196 C.
vitrification
les procédures de non-équilibre refroidissement ultra- rapide , tels que la vitrification

utiliser des concentrations plus élevées de cryoprotecteurs couplés avec un taux de gel atteint presque instantanée en plongeant les cellules directement dans l'azote liquide. La vitrification contourne la phase de formation de cristaux de glace et déplace l' eau directement dans une phase ressemblant à du verre . La vitrification permet d'obtenir le même point de terminaison en tant que la congélation lente , mais à un taux de -3000C/min , par rapport à 10C/min ou plus . Pour la vitrification , les cellules sont habituellement placés sur la pointe d'un cryoprotecteur et de l'excès de la paille est retirée , laissant juste assez pour que la cellule adhère au récipient par la tension de surface , avant de plonger dans de l'azote liquide . Étant donné que le gel est si rapide , la durée de l'exposition à des cryoprotecteurs est bien moindre, et des concentrations beaucoup plus élevées de cryoprotecteurs peut être tolérée par la cellule. Réchauffement de la cellule pour retourner au fonctionnement normal du métabolisme doit aussi être incroyablement rapide . La manipulation des échantillons vitrifiés est beaucoup plus exigeante que les échantillons congelés lente parce que même une brève exposition à une température supérieure à celle de l'azote liquide peut commencer un processus de réchauffement imprévue et regel , ce qui est préjudiciable à la cellule .