Procédure d'exécution d' un dosage ELISA

Un ELISA , ou un dosage par immunoabsorbant lié à une enzyme , est une technique de laboratoire biochimique fait de détecter un antigène (par exemple une protéine ) ou un anticorps dans un échantillon expérimental . L'essai tire parti de la liaison anticorps-antigène , et peut être utilisé pour doser d'autres mécanismes cellulaires et moléculaires de liaison aussi bien. Dans un dosage ELISA à base de protéines , un " capturer " anticorps ou la protéine est fixées dans un plat de dosage et autorisés à adhérer à l'antenne , après quoi la "sonde" agent (tel que de l' une protéine d'intérêt ) est défini par et mis en incubation avec l'agent de capture . Après plusieurs lavages , une " détection " l'anticorps est ajouté afin de visualiser la présence ou l'absence d' anticorps-antigène ou protéine - protéine de liaison . Choses que vous devez
plat dosage (par exemple , le bloc 96 puits) Photos capture anticorps (dilué à 5 ug /ml dans mM NaHCO2 50 , pH 9,6 )
sonde anticorps /protéine (dilué à diverses concentrations )
anticorps de détection (par exemple , un anticorps couplé à la peroxydase de raifort )
tampon PT ( 1x PBS , 0,05 pour cent de Tween- 20 ) Photos de blocage tampon ( 1x PBS avec 5 mg /ml de BSA , soit 5 pour cent lait écrémé en 1x PBS ) Photos réactif de détection ( c. de mélange réactif TMB)
laboratoire mécanique shaker
chambre froide ou un réfrigérateur
pipette et conseils
afficher Instructions

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Diluer l'anticorps de capture à 5 ug /ml dans mM NaHCO2 50 (pH 9,6 ) . Ajouter 50 ul dans chaque puits de la boîte de l'échantillon utilisé pour le test . Couvrir avec du plastique ou de l'aluminium et incuber une nuit à 4 ° C sur un agitateur .
2

Déverser anticorps de capture et laver deux fois avec 200 pi de tampon PT . Ajouter 200 ul de tampon de blocage par puits ( de lait écrémé PB ou 5 pour cent ) . Incuber partout de deux heures à une nuit en agitant à 4 ° C.
3

Déverser tampon de blocage et laver 4 fois avec 200 pi de tampon PT . Ajouter "sonde" échantillons de protéines à diverses concentrations en PB ou 5 pour cent de lait écrémé , en ajoutant 100 ul par puits . Incuber une heures sous agitation à 4 ° C. Déverser des solutions de sonde et laver six fois avec 200 pi de tampon PT .
4

Ajouter anticorps de détection ( anticorps conjugué à HRP ) dilué 1:4000 dans le tampon PB ou 5 pour cent de lait écrémé ( soit une contenant 0,05 pour cent de Tween-20 ) , en ajoutant 50 uL par puits d'échantillon . Incuber pendant 30 minutes à une heure en agitant à 4 degrés C.
des 5

vider solution d'anticorps de détection et laver 6 fois avec 200 pi de tampon PT par puits , suivie d'un lavage deux fois avec 200 pi de 1x PBS ( tampon phosphate salin ) . Déverser PBS et ajouter 100 ul de réactif de détection par puits ( HRP , utiliser le réactif fraîchement mélangé TMB en mélangeant substrat TMB et peroxyde à 01h01 ) . Incuber pendant 15 minutes à température ambiante en agitant de temps en temps.

Lors de l'utilisation TMB et HRP : Enfin , ajouter 100 pi de 1 M H3PO4 (acide phosphorique ) par puits pour arrêter la réaction de TBM

Lire plaque utilisant un lecteur d'analyse d'échantillon , comme un lecteur de plaques à 96 puits . . ( Pour HRP et TMB , utiliser le modèle " ELISA point final Assay " disponible sur la plupart des lecteurs . )