Cell- Based protocole ELISA
ELISA ou test immuno-enzymatique , est utilisé comme un outil de diagnostic en médecine et dans la recherche biologique pour quantifier la quantité d'une protéine spécifique . ELISA utilise des anticorps pour détecter la protéine d'intérêt et un réactif qui produit une couleur . La quantité de couleur se rapporte à la quantité de protéine . Culture cellulaire
cellules doivent être placés dans les puits d'une plaque de 96 puits avec 100 micro- litres de milieu de culture et les cellules laissées à reposer une nuit . Si vous êtes étudiant la réaction des cellules à un facteur , les cellules doivent être privées de sérum pendant 24 heures et ensuite stimulées avec le facteur à l'étude .
Fixation et Anticorps primaire
Après élimination du milieu , les cellules sont traitées avec un fixateur tel que le formaldehyde 3 pour cent , ou du méthanol. La membrane de la cellule a besoin d'être perméabilisées pour permettre à l'anticorps de pénétrer dans la cellule. Perméabilisation peut être obtenue par l'utilisation de 0,1 pour cent de Triton , si le methanol n'a pas déjà été utilisé . La liaison non spécifique peut être empêchée par l'utilisation de 10 pour cent de sérum de veau foetal dilué dans une solution saline tamponnée au phosphate . Après le retrait du bloc , l'anticorps primaire peut être appliqué et incubé pendant une heure .
Anticorps secondaire et Stain
Supprimer l'anticorps primaire , et lavage trois fois . Ajouter un anticorps secondaire lié à un agent de détection , tels que la peroxydase de raifort . Incuber pendant une heure . Washington Ajouter solution de substrat de chimioluminescence . Élaborer et analyser la plaque de l'intensité de la couleur .
