Méthodes de mesure de la NADPH - oxydase

L' enzyme oxydase NADPH est identifié en tant que producteur d'espèces réactives de l'oxygène au cours de processus, y compris la croissance des cellules musculaires lisses vasculaires . Ces espèces réactives sont liées à une variété de maladies , y compris l'hypertension, le diabète, le cancer et l'inflammation , des procédés pour le contrôle de l' activité de cette enzyme est essentielle pour le développement possible de traitement. NADPH oxydase

la NADPH oxydase appartient à une famille d'enzymes qui aident à transfert d'électrons entre le NADPH et de l'oxygène . Cependant, la NADPH oxydase a la capacité unique de production d' espèces réactives de l'oxygène à partir de cette réaction, par rapport à d'autres membres de la famille où les espèces réactives de l'oxygène est généré par d'autres moyens . Un complexe protéique multimérique , la NADPH oxydase se compose de la flavocytochrome b558 membranaire , qui est utilisé comme marqueur de mesure .
Espèces réactives de l'oxygène ( ROS ) Génération

la principale source de ROS , notamment le peroxyde d'hydrogène , la NADPH oxydase produit de petites quantités mais cohérentes via son isoforme exprimée dans les vaisseaux sanguins , qui sont impliqués dans les processus de signalisation . Cette production constante peut éventuellement saturer le système antioxydant naturel , entraînant une perte de composés protecteurs tels que l'oxyde nitrique , et la génération de ROS encore plus puissant .

Méthode de chimiluminescence

chimiluminescence permet très sensible , la mesure automatique de l'activité de la NADPH oxydase dans une plage de concentrations . Au cours de ce procédé , le substrat de la NADPH est ajouté à un échantillon de tissu contenant de la NADPH oxydase . Lors de la réaction , ROS est produite et réagit avec la lucigénine composé pour produire un effet de chemilluminescent , qui est mesurée . La luminescence est directement proportionnelle à l'activité de la NADPH oxydase , comme l'enzyme détermine la vitesse de la réaction .
Kinetic Assay par cytométrie en flux

Dans cette méthode , des échantillons de tissus sont analysés par cytométrie de flux . La moelle osseuse est séparé de l'échantillon en utilisant une solution saline équilibrée de Hanks . Taches spécifiques et des anticorps de détection sont ajoutés à l'échantillon dans des tubes de polystyrène . L'échantillon est alors incubé , lavée avec une solution saline équilibrée de Hanks , marquée avec des molécules sondes et préparé à partir de la cytométrie en flux . Tubes de contrôle sont également faites pour comparaison et pour calibrer le cytomètre de flux . La machine est alors couru et des mesures enregistrées .