Comment faire pour dépanner un Fragment Trois ligature

ligature est une méthode utilisée dans la recherche biologique pour rejoindre volets distincts d'ADN . Le processus a été simplifié en utilisant des kits de ligature disponibles dans le commerce . Une procédure de ligature est généralement suivie par une transformation , un processus insertion de l'ADN rejoint dans un récipient de vecteur bactérien , de cloner et amplifier l'ADN . En raison de la complexité de la méthode , des résultats souvent ne correspondent pas avec le produit désiré et nécessitent dépannage . Ceci est plus prédominante dans une tentative de joindre plusieurs fragments , par exemple en triple ligature. Choses que vous devez
kit de ligature
ligature protocole
gel d'agarose
50 X TBA tampon ( 242 g de base Tris , 57,1 ml d'acide acétique glacial , 100 ml d'EDTA 0,5 M dilué à 1 litre avec de l'eau )
eau déminéralisée
purification kit d'ADN
Voir Instructions
dépanner transformation
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Formuler une liste d'étapes impliquées dans la ligature et la transformation . Dépannage tout protocole scientifique commence généralement par la dernière étape , le travail en arrière .
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Comparez produit d'ADN purifié à partir de l'échantillon de l'ADN de contrôle , fourni avec le kit . Une fois que l'ADN a été transformé dans des bactéries et clone , il peut être isolé , purifié et vérifiée par électrophorèse sur gel d'agarose. Les résultats de l'électrophorèse d'indiquer si la transformation a réussi.
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Déterminer la croissance bactérienne pendant le clonage . La plupart des vecteurs bactériens sont construits de sorte que ceux ayant un insert d'ADN - va croître sur un milieu contenant de l'ampicilline , ou d'un autre antibiotique . Faible croissance pourrait établir que l'échantillon d'ADN n'a pas été inséré avec succès dans le vecteur .
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Vérifiez que l'échantillon d'ADN ligaturé a été purifié , avant la transformation . Sels tampons et enzymes de ligation peuvent inhiber la transformation de l'ADN inséré . Il est également important de s'assurer que l'enzyme de ligation a été inactivée par la chaleur, après l'achèvement de la procédure de ligature. Ligase active pourrait interférer avec la transformation .
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Vérifiez la date en stock bactérienne utilisée pour la transformation . Les vieilles cellules bactériennes perdent efficacité au fil du temps . Finalement, les cellules bactériennes sont incapables de transformation et clonage de qualité. Une fois le processus de transformation a été diagnostiquée, vous pouvez commencer à analyser la procédure de ligature .
Dépannage ligature
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Confirmez la pureté de votre échantillon d'ADN , avant la ligature . Contaminants sel dans l'échantillon d'ADN pourraient entraîner de mauvais ligature . L'échantillon d'ADN doit être purifié et exempt de sels et d'enzymes , avant qu'il ne soit utilisé dans la ligature .
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Vérifiez si les extrémités des brins d'ADN à ligaturer sont émoussées ou collant . La ligature est utilisée pour lier les brins séparés avec des extrémités franches ou des extrémités cohésives , après digestion avec les enzymes de restriction désignés. T4 ADN ligase est l'enzyme de choix pour l'ADN à extrémité émoussée - mais il fonctionne également pour l'ADN avec des extrémités collantes . Autres ligases d'ADN ne peuvent travailler que pour l'ADN , après une digestion de restriction pour créer des extrémités collantes . Il est important d'utiliser la ligase appropriée pour le test ADN .
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Vérifier concentration des échantillons d'ADN avant la ligature . En utilisant l'ADN avec une concentration élevée provoque souvent l'ADN pour devenir linéaire . Les instructions de la trousse fourniront des informations sur le montant exact de l'ADN à utiliser dans une réaction de ligature .
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Remplacer enzyme ligase avec un nouveau lot . Les enzymes sont particulièrement sensibles à la température ambiante et la poursuite des cycles de gel-dégel . La ligase pourrait être endommagé suite à un certain nombre d'utilisations , tout simplement par la congélation et la décongélation de trop nombreuses fois . Certains kits recommandent ligase être répartie dans des petites portions pendant la première utilisation , de réduire le nombre de fois où il est re- congelés .
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Vérifiez le kit de ligature . Souvent, le problème avec ligature utilise un kit qui a expiré ou ont été contaminés par un autre ADN et des sels .