Protocole de coloration intracellulaire pour cytométrie en flux

cytométrie de flux est un outil qui est utile dans l'étude des protéines cellulaires. Il utilise l'émission de lumière ou de fluorescence des protéines dans la cellule. Des anticorps ou des sondes marquées avec la fluorescence sont utilisées pour étudier les protéines spécifiques . La cytométrie en flux est utilisée pour diagnostiquer un certain nombre de maladies , notamment le cancer, mais est également utile dans la recherche médicale. Cellules de fixation

cellules doivent être fixés pour maintenir la stabilité des protéines intracellulaires . Un certain nombre de fixateurs peut être utilisé tel que le formaldéhyde ou l'acétone glacée . Après la fixation , la membrane de la cellule a besoin d'être permealized pour permettre à l'anticorps d'entrer dans la cellule. Détergents tels que Triton ou NP- 40 , ou le méthanol glacée peuvent être utilisées pour faire des trous dans la membrane cellulaire .

Coloration

Laver les cellules dans le tampon de blocage 0,5 pour cent de sérum -albumine bovine dilué dans une solution saline tamponnée au phosphate , BSA /PBS . Les cellules sont incubées dans du tampon de blocage pour réduire la liaison non spécifique. Ajouter l'anticorps primaire dilué dans du tampon de blocage et laisser incuber à la température ambiante , pour une longueur de temps optimisé . Laver avec du tampon de blocage .

Analyse

incuber l'anticorps secondaire , qui est marqué avec un marqueur fluorescent , à la température ambiante pendant 30 minutes . Pour éliminer les cellules de lavage d'anticorps non liés au tampon de blocage . Cellules de spin dans une pastille , puis remises en suspension dans du PBS et analyser sur cytomètre de flux .