Protocole de biotinylation de surface cellulaire
Biotinylation utilise la capacité de la biotine soluble à se lier à des protéines cellulaires. La biotine se lie à la streptavidine de la protéine et est donc utile dans la biologie cellulaire pour visualiser les protéines de la cellule . Biotinylation permet le marquage sécuritaire des protéines par rapport à des techniques telles que la radioactivité et n'affecte pas le fonctionnement normal de la cellule. Il permet aux chercheurs d'étudier les protéines cellulaires telles que des récepteurs , et qui permet une meilleure compréhension des maladies et des processus pathologiques. Étiquetage suspendu Cellules
Laver les cellules en phosphate glacée solution saline tamponnée (PBS ) pour éliminer les contaminants . Tampons contenant tris et de la glycine seront en concurrence avec biotinylation et doivent être évités . Pour éviter biotinylation des protéines internes , le marquage peut être effectué à 4 ° C ou en présence d' azoture . Resuspendre les cellules dans du PBS et la biotine soluble , sulfo -NHS- LC- biotine .
Étiquetage adhérents cellules
Laver les cellules dans du PBS et incuber avec un produit tel que sulfo -NHS- LC- biotine. Les cellules sont ensuite grattées dans un plat et lysées dans un tampon contenant le détergent Triton X - 100 et préparés pour la visualisation .
Préparation cellules marquées
la suite incubation, les cellules sont centrifugées en un culot et lavées dans du PBS. Les cellules sont remises en suspension dans du PBS et on a purifié le gel avec de l' IgG . La protéine liée est dilué dans un tampon de chargement et chauffé à 100 degrés Celsius .
Visualisation cellules
protéines dilués peuvent être visualisés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide- dodécylsulfate de sodium ( SDS- PAGE ) suivie d'un transfert de la protéine et le mélange d'enzymes , le peroxyde de streptavidine - raifort . Les blots sont visualisés avec une réaction chimique --- --- chimioluminescence qui émet de la lumière . Spécificité de la biotinylation peut être confirmé avec des anticorps pour la protéine à l'étude .
