QuikChange mutagenèse Protocoles
QuikChange mutagenèse est le nom de marque d'un kit utilisé dans la recherche en biotechnologie pour induire une mutation génétique ou altération de l'ADN . Agilent Technologies est l'entreprise derrière le produit , qui est disponible en deux versions , QuikChange II et QuikChange foudre . Les kits contiennent une solution tampon , l'enzyme ADN polymerase , des réactifs de couleur , des séquences ou des amorces d'ADN , et des échantillons de cellules . Protocole de réaction Mutant Strand Synthesis
techniciens synthétisent deux oligonucléotides ou des séquences d'ADN courte contenant la mutation désirée . Ensuite, ils préparent la réaction de contrôle avec la séquences d'ADN , d'une solution de mélange de dNTP et de l'ADN polymérase de l'enzyme , en ajoutant de l'eau distillée . Plus tard , on prépare une série d' échantillons à l'aide de réactions diverses concentrations d' ADN double brin ( ADNdb ) , tout en maintenant constante la concentration des amorces ou des oligonucléotides , selon les instructions du fabricant. Ils gardent les échantillons à 203 degrés F pendant 30 secondes . L'échantillon contenant le nombre de segments d'ADN à deux est également testée dans des cycles de température , une technique dans laquelle des changements de température pendant de courtes périodes de temps . Enfin , les échantillons sont placés sur de la glace pendant deux minutes .
Dpn I digestion du Protocole de produits d'amplification
Dpn I enzyme de restriction coupe l' ADN à des sites spécifiques . Un micro- litres de cette enzyme est ajouté directement à chaque réaction d'amplification en dessous de sa couche d'huile minérale standard en utilisant une micro- pipette ou un embout de pipette d'aérosol résistant spécialisé . Cependant, une couche d'huile minérale est seulement nécessaire si le cycleur thermique , un appareil utilisé pour amplifier des segments d'ADN , ne dispose pas d'un assemblage à chaud supérieure . La réaction est mélangée doucement et ensuite mise dans une micro- centrifugeuse pendant une minute. Après cela, les échantillons sont incubés à 98,6 degrés F pendant une heure .
Transformation des cellules XL1-Blue supercompetent Protocole
XL1-Blue est une tétracycline résistant lignée cellulaire qui est livré avec les kits QuikChange mutagenèse . Au cours de ce protocole , les techniciens décongeler les cellules , qui étaient auparavant conservés à -112 degrés F , sur la glace . Puis ils ajoutent un micro- litre de l'ADN Dpn I - traitée , la chaleur à 107,6 degrés F pendant 45 secondes et placent la réaction sur de la glace pendant deux minutes . Après cette procédure , les techniciens ajoutent une préparation de NZY ( hydrolysat de caséine et l'extrait de levure ) préchauffé à 107,6 degrés F et incuber pendant une heure. La préparation est ensuite mis sur des plaques de gel d'agar-agar et incubée à 98,6 degrés F pendant 16 heures .
