Comment mesurer NADH

NAD et NADH sont deux nucléotides pyridiniques impliqués dans le métabolisme . NADH et NAD sont des co- enzymes présentes dans les mitochondries , les centrales électriques de la cellule. Les deux NAD et NADH sont impliqués dans les réactions cellulaires tels que la respiration et la photosynthèse où l'énergie et de l'hydrogène sont générés . NAD et NADH carburant réactions biochimiques qui nécessitent un certain nombre d' enzymes pour produire de l'ATP , la principale source d'énergie dans les cellules . Choses que vous devez
cellules ou de tissus à l'étude
kit de dosage de NADH
solution saline tamponnée au phosphate sec Ice bloc de chauffage de
plaque de 96 puits
Centrifugeuse
étiqueté tubes
lecteur de plaque de Vortex
la concentration connue de NADH de
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Essai
1

Laver les cellules ou les tissus à l'étude avec le phosphate froid une solution saline tamponnée , du PBS. Extraire des cellules ou briser le tissu dans un tampon d'extraction en plaçant le mélange sur de la glace sèche pendant 20 minutes, puis à température ambiante pendant 10 minutes . Répétez .
2

Vortex pendant 10 secondes . Tourner dans une centrifugeuse pendant 5 minutes pour obtenir un culot cellulaire ou de débris de tissu. Retirer le surnageant , la phase liquide , et placer le liquide dans un tube propre .
3

Filtrer le surnageant à travers un filtre spécialisé pour éliminer les enzymes qui se décomposera NADH .
4

Retirer 200 micro litres , place dans un tube propre et de la chaleur à 60 degrés Celsius dans un bloc de chauffage pendant 30 minutes pour dénaturer NAD . Phase liquide frais et centrifugeuse et enlever . Transfert de 50 micro litres dans une plaque de 96 puits; chaque échantillon doit être en double ou en triple . Pour déterminer NAD totale , NADT , ne chauffe pas .
5

Préparer et ajouter vélo mélange sur la plaque de 96 puits . Mélanger et incuber pendant 5 minutes. Ajouter 10 micro litres de révélateur et laisser incuber à température ambiante pendant 4 heures . Ajouter la solution d'arrêt . Lire changement de couleur sur un lecteur de plaque ou fluorimètre selon kit .
Courbe et calcul standard
6

Préparer une courbe standard en prenant une concentration connue de NADH et le diluant dans un tampon d'extraction . Diluer en différentes concentrations , en assurant le volume final reste le même que les échantillons d'essai . Plaque sur la même plaque à 96 puits comme échantillons d'essai. Lire la densité optique .
7

Dessinez le graphique de la courbe standard avec une concentration sur l'axe X et la densité optique sur l'axe Y . Prenez une moyenne de chaque échantillon de test et lire la concentration à partir du graphique de la courbe standard.
8

Calculer le rapport NAD /NADH en soustrayant NAD totale , NADT , de NADH , puis en divisant par le NADH .
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