Comment faire Anticorps dilutions pour IHC

immunohistochimie ( IHC ) est une technique de spécialiste utilisé par les scientifiques de visualiser les cellules dans les tissus qui ont été placés sur une lame et colorées avec un anticorps approprié qui reconnaît une protéine qui est unique à la cellule ou le tissu sous enquête. Dilutions d'anticorps ( des titrages ) , doit être effectuée en utilisant les conditions expérimentales spécifiées dans son propre protocole de l'utilisateur , et non pas que du fabricant de l'anticorps , car les deux ne peuvent pas être identiques. Choses que vous devez
cellules à colorer
le tampon de dilution ( " diluant " )
Pipettes et pointes de Anticorps
Microfuge tube de papier d'aluminium Photos Photos marqueurs de laboratoire et étiquettes pour les tubes boîte à lames abri de la lumière
glace
Voir Instructions
1

Vérifier et préparer l'anticorps . Vérifier que l'anticorps a été élevé dans le bon hôte , et réagit avec la version exacte de la protéine (appelée l'isoforme ou variant d'épissage ) qui est testée . Avec une pipette , prendre soin d'une partie de 10 microlitres de cette étiquette et de « réserve personnelle .

Si seules de très petites quantités d'anticorps sont disponibles , ignorez cette étape .

Garder un stock personnel d'anticorps est une pratique courante dans tous les laboratoires , car il empêche la contamination croisée du stock initial . Répartir ce dans un tube de micro abri de la lumière , ou un tube de micro normale qui est enveloppé dans une feuille d' aluminium pour le protéger de la lumière directe .

Gardez ce tube sur de la glace , de préférence dans un Esky avec un couvercle étanche à l'air , nouveau pour minimiser la lumière , qui peut détruire l'anticorps . Prenez note de la concentration de l'action originale (par exemple, 100 unités par millilitre , 1 milligramme par microlitre et ainsi de suite ) sur le tube , y compris le nom de l'anticorps et , le cas échéant , un tampon il est dilué dans ( par exemple du sérum , le sérum physiologique , ou de l'eau , etc.)
2

Préparer le tampon de dilution , également connu sous le diluant d'anticorps. Assurez-vous que cela est compatible avec l'anticorps et la procédure d' immunohistochimie est utilisée , par exemple, il ne doit pas occulter une fluorescence ou empêcher un marquage de l'anticorps secondaire ultérieure . Faire une dilution standard d'immunohistochimie (également le tampon de blocage) en mélangeant 1X tampon phosphate salin avec 1 % de Triton - X100 , 10% de sérum de veau foetal et de l'azoture de sodium à 0,2 % .
3

Titrer l' anticorps. Avec la concentration donnée d' anticorps dans le stock personnel (exprimée en unités de concentration tels que microgramme par microlitre ) , de déterminer la quantité d'anticorps nécessaire pour obtenir 10 microgrammes d'anticorps .

Mettre en place une série de dilution par un volume de pipetage équivalent à 2 microgrammes d'anticorps (par exemple X microlitres ) , à 100 microlitres de diluant et mélanger par pipetage de haut en bas . De cette dilution de départ, prendre les mêmes X microlitres et l'ajouter à une suite de 100 microlitres de diluant . Répétez jusqu'à ce que 8-10 dilutions (ou une série ) est constitué .

Le dernier tube devra donc la plus faible concentration et être la " saturation " concentration qui va générer le plus haut niveau de signal pendant l'expérience. Toutefois , la concentration idéale sera un peu plus concentré que cela, de sorte que pas trop de signal est produit , ce qui peut provoquer des erreurs de fond .

Marquez les tubes correctement avec les nouvelles concentrations diluées.