Molecular Cloning Protocols

protocoles de clonage moléculaire englobent les méthodes utilisées pour la définition , l'isolement et la réplication d'une séquence d'ADN. Les protocoles traditionnels de restriction et de ligature clonage initient la fragmentation de l' ADN avec des endonucléases restreintes (enzymes qui coupent les brins d'ADN dans des sites de restriction), fragment d'ADN de ligation ( la réparation des discontinuités dans les molécules d'ADN ) , la transfection ( de l'introduction de l'acide nucléique dans un corps de la cellule ) et la sélection ( le choix des génomes individuels pour la réplication ) . Isolation

Les protocoles pour l'isolement d'un fragment d'ADN , la première étape de clonage moléculaire , souvent d'incorporer une réaction en chaîne de la polymérase (PMR ) , qui utilise des cycles de chauffage et de refroidissement pour amplifier des fragments d'ADN . Pour atteindre la taille de la séquence d' objectif , d'autres protocoles incluent la sonication de l'ADN, digestion par enzyme de réaction et l'utilisation d'oligonucléotides synthétisés chimiquement . Ces protocoles varient en fonction de l'ampleur et de la quantité d'ADN isolé nécessaire .

Ligature

protocoles pour la ligature impliquent l'utilisation d'une enzyme , l'ADN ligase , à se joindre à des molécules d'ADN avec une liaison covalente . Le protocole dicte combinant des fragments d'ADN , le vecteur de clonage , un tampon de ligature , l' ADN ligase et de l'eau stérilisée dans un tube à centrifuger et incuber une nuit à 4 degrés Celsius .

Transfection

protocoles pour la transfection ou la perfusion ADN dans une cellule en utilisant des moyens non viraux , impliquent souvent l'injection d'ADN directement dans le cytoplasme cellulaire. D'autres méthodes comprennent l'utilisation de réactifs chimiques tels que le phosphate de calcium et de lipides, de livrer le complexe de transfection à travers la membrane cellulaire . Cette méthode permet de tester les effets de la modification génétique sur le fonctionnement de gènes spécifiques .
Sélection

sélection , ou le dépistage , les protocoles de déterminer quelles cellules déroulées avec succès l'insert d'ADN et indiquent dont les cellules ont besoin d'isolement. Une centrifugeuse de cellules qui contiennent des récoltes l'ADN transfecté , qui sont ensuite mis en incubation dans un lysozyme ( une enzyme d'origine naturelle) de tampon et traitées avec un détergent alcalin , ce qui donne les protéines et les membranes solubilité . Utilisation de l'acétate de faire précipiter les protéines , une centrifugeuse et une gaze de filtrer le surnageant contenant l'ADN ( le liquide soluble restante à partir d'un composé centrifugé ) . Le surnageant est précipité par du polyéthylèneglycol , centrifugé , et une suspension dans le chlorure de césium et d' un tampon de bromure d'éthidium. Le bromure d'éthidium colore l' ADN selon la densité , et en utilisant une lumière UV à ondes longues , l'ADN de bande inférieure est extraite avec un cc seringue cinq . Une colonne échangeuse d'ions équilibrée sépare l' ADN à partir du bromure d'éthidium et le chlorure de césium , et le culot d'ADN final est mis en suspension dans une solution tampon et détecté par électrophorèse sur gel d'agarose.